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Claudin18.2說(shuō)明書(shū)

說(shuō)明書(shū)編號(hào)：MyR1-CLDN18.2253

（本抗體僅供研究使用，不用于臨床診斷）

【產(chǎn)品名稱(chēng)】

【產(chǎn)品編號(hào)及包裝規(guī)格】

【預(yù)期用途】

本抗體試劑適用于福爾馬林固定、石蠟包埋的人體組織切片的免疫組織化學(xué)染色，用于標(biāo)識(shí)Claudin18.2蛋白在組織中的表達(dá)。

Claudin 18.2屬于緊密連接蛋白家族中的一種亞型。在正常的組織中僅表達(dá)在分化的胃粘膜表皮細(xì)胞上，不表達(dá)在胃干細(xì)胞上，其它正常組織中幾乎沒(méi)有表達(dá)。而在多種腫瘤組織中高度表達(dá)，比如胃癌(60%~80%)、胰腺癌(50%)、食管癌(30%~50%)和肺癌(40%~60%)等。即使是在胃癌轉(zhuǎn)移病灶中Claudin 18.2同樣有較高的表達(dá)水平，這樣的特點(diǎn)使Claudin18.2成為了一個(gè)頗具潛力的靶向治療與免疫治療新靶標(biāo)。

（注：對(duì)免疫組化染色結(jié)果的解讀應(yīng)結(jié)合病理形態(tài)學(xué)及其它資料進(jìn)行，本染色結(jié)果不作為診斷指標(biāo)。）

【主要組成成分】

單克隆兔抗人Claudin18.2蛋白抗體，克隆號(hào)：MyR1-CLDN18.2，免疫球蛋白分型：IgG。本產(chǎn)品為組織培養(yǎng)上清，含有0.05 mol/L Tris-HCl（pH 7.2）、0.015 mol/L疊氮鈉（N_aN₃）及蛋白穩(wěn)定劑。

【儲(chǔ)存條件及有效期】

試劑需在2-8℃(不可低于0℃)避光保存。每次使用后應(yīng)立即放回2-8℃冰箱保存。有效期見(jiàn)產(chǎn)品外包裝（注：如果試劑未按上述條件儲(chǔ)存, 可能影響其使用效果）。

【免疫組化染色原理】

在免疫學(xué)中，抗原抗體分子由于結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)和彼此親和性會(huì)發(fā)生特異性結(jié)合，基于此原理，抗體將會(huì)與待測(cè)人體組織及細(xì)胞中特異的抗原/蛋白結(jié)合。隨后通過(guò)氧化還原化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的酶顯色劑顯色，從而顯示組織及細(xì)胞內(nèi)的抗原分布。

首先，本抗體與待測(cè)組織上的抗原特異性結(jié)合；其次，酶標(biāo)抗小鼠/兔IgG聚合物識(shí)別已經(jīng)連接上抗原的抗體；再次，加入顯色底物，聚合物上的辣根過(guò)氧化物酶可以催化DAB顯色液中的H₂O₂分解，使聯(lián)苯胺氧化變成聯(lián)苯亞胺，從而使組織切片中抗原位點(diǎn)處出現(xiàn)黃色或棕黃色著色；最后對(duì)樣本進(jìn)行復(fù)染和封片。通過(guò)顯微鏡觀測(cè)顯色情況，推斷組織切片上該抗原的存在位置和表達(dá)情況。

【樣本要求】

新鮮活檢或手術(shù)樣本組織，經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定6-24小時(shí)，按技術(shù)規(guī)范要求進(jìn)行取材、脫水、石蠟包埋制成蠟塊。蠟塊在常溫條件下保存有效期5年。

對(duì)標(biāo)本蠟塊進(jìn)行切片，厚度3-5μm，粘附在經(jīng)防脫處理的載玻片上，在58-60℃恒溫箱中烤片1小時(shí)，以備染色。暫不使用的白片在室溫（15-25℃）下保存（最好防氧化處理），為了良好地重現(xiàn)組織切片中的抗原分布情況，建議在7日內(nèi)完成免疫組化染色。

【染色方法】

以下為針對(duì)手工免疫組化法推薦的配置及步驟，如果采用自動(dòng)化免疫組化儀器進(jìn)行染色，請(qǐng)根據(jù)不同的儀器及顯色試劑盒進(jìn)行調(diào)整。一次完整的免疫組化實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性組織對(duì)照、陰性組織對(duì)照以及空白(或陰性)試劑對(duì)照，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的評(píng)估及驗(yàn)證請(qǐng)參照【質(zhì)量控制】和【染色結(jié)果的解釋】。

1） 所需儀器、設(shè)備：

電磁爐、不銹鋼鍋、計(jì)時(shí)器、孵育濕盒、染色架、染色缸、蓋玻片、光學(xué)顯微鏡（40×-200×）、洗瓶、抽紙、移液器等。

2） 試劑、材料準(zhǔn)備：

本抗體試劑工作液使用前無(wú)需稀釋,如為濃縮液，使用前推薦用PBS緩沖液或抗體稀釋液按1:100-1:200稀釋成工作液。PBS緩沖液、抗原修復(fù)液、二抗以及DAB顯色液等試劑的配制請(qǐng)參見(jiàn)各產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)。

實(shí)驗(yàn)所需的其他材料如下所示：

PBS緩沖液（pH7.2-7.4）、Tris-EDTA抗原修復(fù)液（pH9.0）、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑、HRP酶標(biāo)記的抗小鼠/兔IgG聚合物、DAB顯色液、蘇木素染色液、空白(或陰性)對(duì)照試劑、陽(yáng)性及陰性對(duì)照組織切片、二甲苯或二甲苯替代品、乙醇（無(wú)水、 95%、 85%）、蒸餾水或去離子水、封片劑（如中性樹(shù)膠）、防脫載玻片、蓋玻片等。

3） 實(shí)驗(yàn)溫度條件：室溫18℃-28℃。

4） 實(shí)驗(yàn)步驟：

A、脫蠟和水化

（1）將組織切片依次置于2缸新鮮二甲苯中，各浸泡10分鐘；

（2）將組織切片依次置于無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇中，各浸泡5分鐘；

（3）蒸餾水輕柔沖洗1分鐘，沖洗后浸泡在蒸餾水中準(zhǔn)備修復(fù)。

B、抗原修復(fù)（高壓修復(fù)）

（1）取配制好的Tris-EDTA抗原修復(fù)液（pH9.0）于高壓鍋中，將脫蠟水化后的組織切片置于耐高溫塑料切片架上，放入修復(fù)液中，確保組織切片完全浸入修復(fù)液；

（2）蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，大火（1600W/210℃）加熱至噴氣，從噴氣開(kāi)始計(jì)時(shí)2分鐘并調(diào)至中火（800W/130℃），計(jì)時(shí)結(jié)束后，關(guān)閉電磁爐，將高壓鍋平穩(wěn)移離熱源，自然冷卻5分鐘；

（3）將高壓鍋平穩(wěn)轉(zhuǎn)移至水槽中，打開(kāi)流水澆至鍋蓋，使鍋蓋降溫，直至自動(dòng)鎖芯落到原位，關(guān)閉流水，取下限壓閥，小心打開(kāi)鍋蓋（注意蒸汽燙傷），再向鍋內(nèi)緩慢注入流水（避免流水直接沖向組織切片）；

（4）待溫度降至40℃以下時(shí)（水溫不燙手），取出切片架并快速浸入蒸餾水中（避免干片），用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗后浸泡在蒸餾水中準(zhǔn)備阻斷。

（注：修復(fù)后組織切片易干片，后續(xù)操作中“甩去組織切片多余液體”皆需注意不能讓組織干片，否則會(huì)影響染色效果。）

C、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶

（1）甩去組織切片多余液體，將玻片快速置于過(guò)氧化物酶阻斷劑（3% H₂O₂）中浸泡10分鐘；

（2）阻斷結(jié)束，用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗后浸泡在蒸餾水中準(zhǔn)備畫(huà)圈。

D、畫(huà)圈

甩去或小心拭去組織切片周?chē)嘤嘁后w，用免疫組化油筆圍繞組織畫(huà)圈，畫(huà)圈位置應(yīng)距組織邊緣2~3mm處，確保整個(gè)圈包圍全部組織后用蒸餾水輕柔沖洗3分鐘×2次，沖洗掉多余油液后浸泡在PBS緩沖液中準(zhǔn)備一抗孵育。

E、滴加一抗或?qū)φ赵噭?/span>

（1）甩去組織切片多余液體，待油筆畫(huà)的圈完全顯現(xiàn)后滴加一抗工作液使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育30分鐘；

（2）一抗孵育結(jié)束，用PBS緩沖液沖洗2~3次，再轉(zhuǎn)移到PBS缸中浸洗2分鐘×3次。

（注：實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用PBS緩沖液沖洗組織切片時(shí)，勿直接沖洗組織表面，否則可能導(dǎo)致掉片。）

F、滴加HRP酶標(biāo)記的二抗聚合物

（1）甩去組織切片多余液體，待油筆畫(huà)的圈完全顯現(xiàn)后滴加一步法二抗試劑使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育20分鐘；

（2）二抗孵育結(jié)束，用PBS緩沖液沖洗2~3次，再轉(zhuǎn)移到PBS缸中浸洗2分鐘×3次。

G、滴加DAB顯色劑

（1）甩去組織切片多余液體，滴加新鮮配制的DAB顯色劑使其完全覆蓋組織，在濕盒中室溫孵育5分鐘；

（2）DAB孵育結(jié)束，將玻片上的DAB 震落于紙巾上，再放入蒸餾水中充分沖洗3分鐘×2次，終止染色。

H、復(fù)染、返藍(lán)

（1）蒸餾水充分沖洗后，置于蘇木素染色液中復(fù)染8~10秒，復(fù)染后用蒸餾水沖洗干凈；

（2）復(fù)染后，置于1%碳酸鋰溶液中返藍(lán)8~15秒，返藍(lán)后用蒸餾水沖洗干凈。

（注：依據(jù)不同蘇木素染色液的強(qiáng)度調(diào)整復(fù)染時(shí)間，以細(xì)胞核呈現(xiàn)淡藍(lán)到深藍(lán)顏色為宜，過(guò)染或不足染色都有可能影響結(jié)果的判斷。）

I、脫水、透明、封片

（1）甩去組織切片多余液體，將組織切片依次置于85%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇中，各浸泡3分鐘；

（2）脫水結(jié)束，將組織切片置于新鮮二甲苯中，浸泡5~10分鐘；

（3）待組織切片呈透亮狀態(tài)后即可使用中性樹(shù)膠和蓋玻片封片。

5） 結(jié)果判讀：

免疫組化染色結(jié)果要由有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)人員在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色后的切片進(jìn)行觀察并進(jìn)行判讀。

【質(zhì)量控制】

在開(kāi)始解讀待檢標(biāo)本的染色結(jié)果前，應(yīng)該先對(duì)試劑對(duì)照及組織對(duì)照等一系列質(zhì)控的染色結(jié)果進(jìn)行分析確認(rèn)，與已知的陽(yáng)性和陰性結(jié)果對(duì)比，并參考既往質(zhì)控的染色結(jié)果。只有一系列對(duì)照都顯示了與已知相符的染色結(jié)果，待檢標(biāo)本的染色結(jié)果才被認(rèn)為是有效的。一次完整的免疫組化實(shí)驗(yàn)應(yīng)設(shè)立陽(yáng)性組織對(duì)照、陰性組織對(duì)照以及空白(或陰性)試劑對(duì)照，以確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程是準(zhǔn)確可控的。

陽(yáng)性組織對(duì)照應(yīng)該是新鮮的活檢或手術(shù)標(biāo)本，按照與待檢標(biāo)本相同的方法進(jìn)行固定、前處理及石蠟包埋制片的。理想的陽(yáng)性組織對(duì)照應(yīng)該已知含有被測(cè)抗原高表達(dá)及低表達(dá)二種情況，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果能體現(xiàn)出不同待檢標(biāo)本中的不同抗原表達(dá)水平，尤其可避免漏檢低表達(dá)的病例。正常的陽(yáng)性組織對(duì)照染色結(jié)果表明待檢標(biāo)本組織制備正確，染色方法適當(dāng)。每次染色實(shí)驗(yàn)均需要設(shè)立陽(yáng)性組織對(duì)照。如果陽(yáng)性組織對(duì)照未能顯示正確的陽(yáng)性染色，則該次待檢標(biāo)本的染色結(jié)果應(yīng)該被認(rèn)為是無(wú)效的。（注：陽(yáng)性組織對(duì)照染色結(jié)果正常僅能表明實(shí)驗(yàn)流程及試劑的性能符合要求，并不能作為待檢標(biāo)本染色結(jié)果特異性的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。）

陰性組織對(duì)照也應(yīng)是按照與待檢標(biāo)本相同的方法進(jìn)行固定、前處理及石蠟包埋制片的，并且已知其中沒(méi)有被測(cè)抗原的表達(dá)。每次染色實(shí)驗(yàn)均需要設(shè)立陰性組織對(duì)照，以確認(rèn)抗體的性能，并能夠提供特異性染色的背景。大多數(shù)時(shí)候待檢標(biāo)本組織切片內(nèi)會(huì)含有不同的細(xì)胞類(lèi)型，那些陰性的細(xì)胞可作為內(nèi)部的陰性組織對(duì)照。如果陰性組織對(duì)照出現(xiàn)了特異性陽(yáng)性染色，則該次待檢標(biāo)本的染色結(jié)果應(yīng)該被認(rèn)為是無(wú)效的。

空白(或陰性)試劑對(duì)照可選擇用PBS緩沖液或與一抗同源的IgG替代一抗進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，目的是評(píng)估一抗的特異性染色，判斷是否存在非特異性著色，并對(duì)抗原部位特異性染色提供更好的解釋。空白(或陰性)對(duì)照試劑的孵育時(shí)間和溫度應(yīng)與一抗一致。

【染色結(jié)果的解釋】

免疫組化染色結(jié)果要由有經(jīng)驗(yàn)的專(zhuān)業(yè)人員在光學(xué)顯微鏡下對(duì)染色后的切片進(jìn)行觀察并進(jìn)行判讀。

A、 免疫組化染色結(jié)果應(yīng)該建立在一系列對(duì)照染色結(jié)果都正常的基礎(chǔ)上，否則該次染色結(jié)果應(yīng)該被認(rèn)為是無(wú)效的。

B、 染色結(jié)果陽(yáng)性（+）：在一系列對(duì)照染色結(jié)果都正常的基礎(chǔ)上，受檢組織切片中特定細(xì)胞的特定部位見(jiàn)有棕黃色著色，且無(wú)背景染色，表示被測(cè)抗原存在表達(dá)。

C、 染色結(jié)果陰性（-）：在一系列對(duì)照染色結(jié)果都正常的基礎(chǔ)上，受檢組織切片中特定細(xì)胞中未見(jiàn)棕黃色著色，表示被測(cè)抗原無(wú)表達(dá)或表達(dá)量極低。

【染色方法的局限性】

1） 標(biāo)本的固定和前處理、組織的抗原修復(fù)、抗體孵育溫度及時(shí)間或其他實(shí)驗(yàn)條件的改變都有可能影響染色結(jié)果的正確性。

2） 在每一次染色過(guò)程中，應(yīng)該設(shè)立空白(或陰性)試劑對(duì)照、陽(yáng)性組織對(duì)照及陰性組織對(duì)照，且所有對(duì)照染色結(jié)果都應(yīng)正常，否則該次實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為是無(wú)效的。

3） 完整的免疫組化實(shí)驗(yàn)過(guò)程有多個(gè)步驟，包括試劑的選擇，組織的選擇，固定和處理，切片的準(zhǔn)備，染色及結(jié)果解釋。染色前組織的處理方式能直接影響染色效果。不恰當(dāng)?shù)墓潭?、冰凍、熔化、清洗、烘干、切片或被其他組織或液體污染都可能造成假陽(yáng)性，抗體定位不準(zhǔn)確或假陰性結(jié)果。固定和包埋方法的不同或是組織內(nèi)部的不規(guī)則也可能造成異常的染色結(jié)果。同時(shí)，過(guò)度或不充分的復(fù)染也可能影響結(jié)果的正確解釋。

4） 對(duì)免疫組化染色結(jié)果的解讀應(yīng)結(jié)合病理形態(tài)學(xué)及其它資料進(jìn)行。任何染色或其缺失的解釋都應(yīng)以形態(tài)學(xué)、正確的對(duì)照以及其他試驗(yàn)作為補(bǔ)充。

5） 試劑可能在未經(jīng)測(cè)試的組織中出現(xiàn)非預(yù)期的反應(yīng)。由于腫瘤或其他病態(tài)組織中的抗原表達(dá)具有生物變異性，因此無(wú)法完全消除被測(cè)組織出現(xiàn)非預(yù)期反應(yīng)的可能性。

6） 假陽(yáng)性的結(jié)果可能會(huì)由于蛋白或底物反應(yīng)產(chǎn)物的非免疫學(xué)結(jié)合造成的。它們也可能會(huì)由紅血球和細(xì)胞色素 C 造成的。

【注意事項(xiàng)】

1） 本產(chǎn)品僅用于研究，不做其它用途。

2） 本產(chǎn)品需由專(zhuān)業(yè)人員使用。

3） 本產(chǎn)品含有生物來(lái)源材料，對(duì)其進(jìn)行處理應(yīng)符合相關(guān)要求。

4） 應(yīng)用適當(dāng)?shù)姆雷o(hù)措施，以避免試劑同皮膚和眼睛接觸。

5） 本產(chǎn)品是否適用于非福爾馬林固定組織還未得到證實(shí)。

6） 本產(chǎn)品含有疊氮鈉作為防腐劑，疊氮鈉可以和鉛銅反應(yīng)而形成易爆炸的金屬疊氮化合物。為防止金屬疊氮化合物的形成，應(yīng)用大量的水沖洗以免其堆積。

【參考文獻(xiàn)】

1.    Nakayama I. et. al. Enrichment of CLDN18-ARHGAP fusion gene in    

gastric cancers in young adults. Cancer Sci. 2019 Apr.

2.    Luo J. et. al. CLDN18.1 attenuates malignancy and related signaling pathways of lung adenocarcinoma in vivo and in vitro. Int J Cancer. 2018 Dec.

【生產(chǎn)企業(yè)】

廣州勉易生物科技有限公司

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